氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺研究
【摘要】 目的 研究氧化铝柱层析精制三七总皂苷工艺。方法 采用HPLC法测定三七总皂苷的含量，考察洗脱剂的浓度、洗脱剂的用量和吸附剂用量对工艺的影响。结果 确定最佳精制工艺为：洗脱剂的浓度为55%乙醇，洗脱剂的用量为10倍吸附剂的用量，吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。结论 通过氧化铝柱层析精制后，三七总皂苷的收率大于70%，含量大于80%，说明此精制工艺是可行的。
【关键词】 三七总皂苷 氧化铝 高效液相法
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根及根茎[1]，三七总皂苷是中药三七的有效部位，主要含有三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1等达玛烷型三萜皂苷类化合物[2]。现代药理研究证明：三七总皂苷具有多方面的生物活性，主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[3]。
目前三七总皂苷的富集与纯化一般采用大孔吸附树脂来完成[4]，纯化后三七总皂苷的含量达到60%以上。为了提高药物的安全性和有效性，提高其成药原料药的纯度。本实验拟采用氧化铝柱层析对三七总皂苷的纯化物进行精制[5]，并对工艺进行了考察，为进一步的制剂学研究打下基础。
1 仪器与试药
1.1仪器与设备
RE 52-99旋转蒸器（上海亚荣生化仪器厂）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；JA-1003型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限医疗设备厂）；美国Tsp高效液相色谱仪；Tsp P-2000泵、TspUV-1000UV-VIS检测器；TspPC1000色谱工作站；色谱柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm,大连依利特科学仪器有限公司）。
1.2材料与试剂
三七总皂苷提取物（云南玉溪天然药物有限公司）；三七总皂苷对照品：三七皂苷R1（0745-200008）、人参皂苷Rg1（0703-200015）、人参皂苷Rb1（0704-200115）对照品（中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：A为乙腈，B为水；流速：1.0mL·min-1；采用梯度洗脱法，0～8分钟（26:74），8:10～40:40分钟（34:66）；检测波长203nm；柱温：30℃；进样量20μL。
2.2线性范围关系的考察
分别精密称取三七总皂苷对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各约6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，以峰面积(A)对进样量(μg)进行线性回归，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回归方程分别为：A=327127.8W－681.2（r=0.9991）；A=406964.1W+787.9（r=0.9991）；A=262563.9W－5498.7（r=0.9996），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂Rb1分别在进样量0.2981～0.6956μg、1.2768～2.9792μg和1.1539～2.6925μg范围内时，峰面积与进样量具有良好的线性关系。
2.3精密度试验
取含量测定项下对照品溶液，连续进样六次，记录色谱图，量取峰面积，计算平均值及相对标准偏差，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积平均值分别为151792、802039.7和476940.7，RSD分别为0.81%、1.73%和1.62%，结果表明，本方法精密度良好。
2.4供试品溶液的制备
取上柱流出液浓缩至干，精密称定干粉一定量，用甲醇溶解并转溶至10mL量瓶，滤过。精密量取续滤液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.5工艺参数的考察
2.5.1洗脱剂浓度的考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后分别用35%、55%和75%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总皂苷含量和收率。
从以上结果可知，当用75%乙醇洗脱时，总皂苷含量最高，但收率太低，而用55%乙醇洗脱时虽然收率比用35%乙醇洗脱时略低，但总皂苷含量高6%左右，因此，洗脱剂确定为55%乙醇。
2.5.2洗脱剂用量考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后用55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。
从以上结果可知，随着洗脱剂用量的增加，得到总皂苷的含量逐渐下降，考虑收率，以10倍量55%的乙醇洗脱比较合适。
2.5.3吸附剂用量考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（柱1：中性氧化铝25g，内径2cm；柱2：中性氧化铝50g，内径4cm；柱3：中性氧化铝100g，内径5cm），然后用10倍量55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。
从以上结果可知，随着吸附剂氧化铝用量的增加，收率逐渐降低，而含量呈上升趋势，氧化铝用量为5倍与10倍相比较，前者虽然总皂苷含量略低，但已经大于80%，而且收率较高，因此吸附剂氧化铝的用量确定为5倍。
2.6中试验证结果
取三七总皂苷原料3份，精密称取质量分别为44.4g，42.8g和47.9g，分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱，中性氧化铝用量为三七总皂苷的5倍，然后用10倍量55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，在60℃以下减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC测定方法，分别测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。
从以上三批中试结果可知，按选定的精制工艺可以制备总皂苷含量大于80%的三七总皂苷原料，且收率大于70%，说明此精制工艺是可行的。
3 结论
3.1氧化铝柱层析精制三七总皂苷的最佳工艺为：洗脱剂的浓度为55%乙醇，洗脱剂的用量为10倍量吸附剂的用量，吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。
3.2本实验提出了一种新的三七总皂苷的精制方法—氧化铝柱层析，具有分离效果好、工艺简单、投资少、处理量较大等优点。有文献报道[6]，大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附容量大、安全无毒、再生容易等优点，但由于应用时间相对较短，还存在着一些问题，因此，在纯化中药有效成分的工艺过程中，两种纯化方法可以互相结合，取长补短，共同促进中药制剂的不断发展。
参 考 文 献
[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2005年版二部[S].北京：化学工业出版社， 2005: 9.
[2]甘烦远.三七的化学成分研究概况[J]. 中国药学杂志，1992，27(3): 128.
[3]Chan P, Tomlinson B. Antioxidant efects of Chinese traditional medicine: focus on trilinolein isolated from the Chinese herb sanchi(Panax pseudoginseng)[J]. J Clin Pharmacol, 2000, 40(5): 457.
[4]孙建平，崔淑霞，等.大孔吸附树脂富集三七总皂苷的工艺研究[J].黑龙江医药，2007，3(20): 232-233.
[5]柳叶.氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优化[D].浙江大学硕士学位论文.杭州：浙江大学，2006.
[6]胡军，周跃华，等.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用[J].中成药，2002，24(2): 127-130.
投稿方式：
电话：029-85236482 15389037508 13759906902
咨询QQ：1281376279
网址： http://www.xinqilunwen.com/
电子投稿：xinqilunwen@163.com 注明“所投期刊”
【关键词】 三七总皂苷 氧化铝 高效液相法
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根及根茎[1]，三七总皂苷是中药三七的有效部位，主要含有三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1等达玛烷型三萜皂苷类化合物[2]。现代药理研究证明：三七总皂苷具有多方面的生物活性，主要表现在扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面[3]。
目前三七总皂苷的富集与纯化一般采用大孔吸附树脂来完成[4]，纯化后三七总皂苷的含量达到60%以上。为了提高药物的安全性和有效性，提高其成药原料药的纯度。本实验拟采用氧化铝柱层析对三七总皂苷的纯化物进行精制[5]，并对工艺进行了考察，为进一步的制剂学研究打下基础。
1 仪器与试药
1.1仪器与设备
RE 52-99旋转蒸器（上海亚荣生化仪器厂）；DK-S22型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；JA-1003型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限医疗设备厂）；美国Tsp高效液相色谱仪；Tsp P-2000泵、TspUV-1000UV-VIS检测器；TspPC1000色谱工作站；色谱柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm,大连依利特科学仪器有限公司）。
1.2材料与试剂
三七总皂苷提取物（云南玉溪天然药物有限公司）；三七总皂苷对照品：三七皂苷R1（0745-200008）、人参皂苷Rg1（0703-200015）、人参皂苷Rb1（0704-200115）对照品（中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水。
2 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：ODSC18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：A为乙腈，B为水；流速：1.0mL·min-1；采用梯度洗脱法，0～8分钟（26:74），8:10～40:40分钟（34:66）；检测波长203nm；柱温：30℃；进样量20μL。
2.2线性范围关系的考察
分别精密称取三七总皂苷对照品三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1各约6.0mg、2.5mg和2.5mg置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液3、4、5、6、7mL置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，以峰面积(A)对进样量(μg)进行线性回归，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回归方程分别为：A=327127.8W－681.2（r=0.9991）；A=406964.1W+787.9（r=0.9991）；A=262563.9W－5498.7（r=0.9996），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂Rb1分别在进样量0.2981～0.6956μg、1.2768～2.9792μg和1.1539～2.6925μg范围内时，峰面积与进样量具有良好的线性关系。
2.3精密度试验
取含量测定项下对照品溶液，连续进样六次，记录色谱图，量取峰面积，计算平均值及相对标准偏差，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积平均值分别为151792、802039.7和476940.7，RSD分别为0.81%、1.73%和1.62%，结果表明，本方法精密度良好。
2.4供试品溶液的制备
取上柱流出液浓缩至干，精密称定干粉一定量，用甲醇溶解并转溶至10mL量瓶，滤过。精密量取续滤液1mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.5工艺参数的考察
2.5.1洗脱剂浓度的考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后分别用35%、55%和75%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总皂苷含量和收率。
从以上结果可知，当用75%乙醇洗脱时，总皂苷含量最高，但收率太低，而用55%乙醇洗脱时虽然收率比用35%乙醇洗脱时略低，但总皂苷含量高6%左右，因此，洗脱剂确定为55%乙醇。
2.5.2洗脱剂用量考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（中性氧化铝50g，内径4cm，干法装柱），然后用55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。
从以上结果可知，随着洗脱剂用量的增加，得到总皂苷的含量逐渐下降，考虑收率，以10倍量55%的乙醇洗脱比较合适。
2.5.3吸附剂用量考察
取三七总皂苷原料3份，每份10g。分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱（柱1：中性氧化铝25g，内径2cm；柱2：中性氧化铝50g，内径4cm；柱3：中性氧化铝100g，内径5cm），然后用10倍量55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC法测定总苷含量和收率。
从以上结果可知，随着吸附剂氧化铝用量的增加，收率逐渐降低，而含量呈上升趋势，氧化铝用量为5倍与10倍相比较，前者虽然总皂苷含量略低，但已经大于80%，而且收率较高，因此吸附剂氧化铝的用量确定为5倍。
2.6中试验证结果
取三七总皂苷原料3份，精密称取质量分别为44.4g，42.8g和47.9g，分别用50%乙醇适量溶解，分别转移至氧化铝柱，中性氧化铝用量为三七总皂苷的5倍，然后用10倍量55%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，在60℃以下减压回收乙醇，真空干燥，按HPLC测定方法，分别测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量。
从以上三批中试结果可知，按选定的精制工艺可以制备总皂苷含量大于80%的三七总皂苷原料，且收率大于70%，说明此精制工艺是可行的。
3 结论
3.1氧化铝柱层析精制三七总皂苷的最佳工艺为：洗脱剂的浓度为55%乙醇，洗脱剂的用量为10倍量吸附剂的用量，吸附剂用量为5倍三七总皂苷的用量。
3.2本实验提出了一种新的三七总皂苷的精制方法—氧化铝柱层析，具有分离效果好、工艺简单、投资少、处理量较大等优点。有文献报道[6]，大孔吸附树脂法具有选择性好、吸附容量大、安全无毒、再生容易等优点，但由于应用时间相对较短，还存在着一些问题，因此，在纯化中药有效成分的工艺过程中，两种纯化方法可以互相结合，取长补短，共同促进中药制剂的不断发展。
参 考 文 献
[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2005年版二部[S].北京：化学工业出版社， 2005: 9.
[2]甘烦远.三七的化学成分研究概况[J]. 中国药学杂志，1992，27(3): 128.
[3]Chan P, Tomlinson B. Antioxidant efects of Chinese traditional medicine: focus on trilinolein isolated from the Chinese herb sanchi(Panax pseudoginseng)[J]. J Clin Pharmacol, 2000, 40(5): 457.
[4]孙建平，崔淑霞，等.大孔吸附树脂富集三七总皂苷的工艺研究[J].黑龙江医药，2007，3(20): 232-233.
[5]柳叶.氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优化[D].浙江大学硕士学位论文.杭州：浙江大学，2006.
[6]胡军，周跃华，等.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用[J].中成药，2002，24(2): 127-130.
投稿方式：
电话：029-85236482 15389037508 13759906902
咨询QQ：1281376279
网址： http://www.xinqilunwen.com/
电子投稿：xinqilunwen@163.com 注明“所投期刊”
